-Horas crédito: 3
-Horario de clases: Lunes, Martes, Miércoles, Jueves, Viernes 8:00 – 1:00pm
Teoría: 8:00-9:30. Práctica: 9:30-1:00pm
-Duración: Martes 1 de Agosto al Lunes 21 de Agosto
-Lugar: Aula de Prácticas de
Bioquímica + Aula Interactiva
-Calificación: 1er examen (25%), 2do examen (25%), 3er examen (25%), nota
promedio de informes (25%)
(Descargar syllabus)
Coordinador del curso: Mirko Zimic
(home page)
Profesores responsables:
Jorge Arévalo jazz_peru@terra.com.pe anexo: 2243 (subanexo 25)
Daniel Clark dclark266@gmail.com anexo: 2501
Ana Colarossi anac@upch.edu.pe anexo: 2418
Carla Gallo galloc@upch.edu.pe anexo: 2516
Patricia Herrera phv@upch.edu.pe anexo: 2501
Rocío Inga
ringa@upch.edu.pe anexo: 2417
Giovanni Poletti
polettig@upch.edu.pe anexo: 2516
Mirko Zimic zimic@upch.edu.pe anexo: 2604
Asistentes de práctica:
Francesca Barletta (FB)
francescabarletta@yahoo.es
anexo: 2414
Valeria Soberón (VS) valeria_soberon@yahoo.com anexo: 2414
Olga Timoteo (OT) otimoteo@upch.edu.pe anexo: 2503
Nestor Cabrera (NC) montecristo100@hotmail.com anexo: 2414
Julio Ortega (JO) julius20047@hotmail.com
Secretaria del departamento: Delia García dcfbioq@upch.edu.pe anexo: 2413
Personal Técnico: Manuel Panta
CONTENIDO DEL CURSO:
Capítulo I: Agua, pH y Buffers
-Práctica #1: Seguridad laboratorio. Teoría de errores (Giovanni Poletti) <Martes 1>
-Práctica #2: Calidad de agua y pH (Giovanni Poletti) <Miércoles 2>
-Práctica #3: Buffers (Patricia Herrera) <Jueves 3>
*Primer examen (Lunes 7)
Capítulo II: Técnicas espectrofotométricas y biocatálisis
-Práctica #4: Técnicas espectrofotométricas (Giovanni Poletti) <Viernes 4>
-Práctica #5: Espectros de emisión/absorción (Jorge Arévalo) <Lunes 7>
-Práctica #6: Cinética enzimática (Daniel Clark) <Martes 8>
-Práctica #7: Inhibición enzimática (Patricia Herrera) <Miércoles 9>
-Práctica #8: Metabolitos secundarios (Rocío Inga) <Jueves 10>
*Segundo examen (Lunes 14)
Capítulo III: Purificación de proteínas
-Práctica #9: Manejo de estructuras moleculares (Mirko Zimic) <Viernes 11>
-Práctica #10: Precipitación y diálisis de proteínas (Carla Gallo) <Lunes 14>
-Práctica #11: Cuantificación de proteínas (Carla Gallo) <Martes 15>
-Práctica #12: Cromatografía de proteínas (Daniel Clark) <Miércoles 16>
-Práctica #13: Electroforesis de proteínas (Rocío Inga) <Jueves 17>
-Práctica #14: Herramientas proteómicas (Mirko Zimic) <Viernes 18>
*Tercer examen (Lunes 21)
*Examen sustitutorio (Martes 22)
SOBRE LOS INFORMES:
El cuaderno de trabajo de laboratorio consistirá de un folder de hojas sueltas numeradas. Allí se tomarán directamente los datos y se trabajarán los informes.
Los informes se entregarán en el aula de clase al día siguiente de realizada la práctica, en forma impresa y personal. Los informes serán revisados, calificados y devueltos dentro de las siguientes 48 horas.
Cada informe debe incluir las siguientes secciones:
TITULO
OBJETIVOS
INTRODUCCIÓN (En esta parte se debe mostrar un breve fundamento teórico e información introductoria al experimento)
PROCEDIMIENTO (En esta parte se debe adjuntar directamente la guía de práctica)
RESULTADOS (En esta parte debe adjuntarse directamente la hoja de datos de laboratorio llenada durante la práctica,
anexando los cálculos y/o análisis según sea el caso)
DISCUSIÓN (En esta sección debe mostrarse una discusión racional sobre los resultados obtenidos)
CONCLUSIONES (Esta sección debe ser consisa)
CUESTIONARIO (En esta sección se desarrollarán las preguntas y/o problemas que proponga el profesor responsable de la
práctica)
CONTENIDO DETALLADO DEL CURSO
CAPÍTULO I: AGUA, pH y BUFFERS
Práctica #1: Seguridad en el laboratorio y teoría de errores. (Martes 1)
Coordinador de práctica: Giovanni Poletti
*Teoría: (descargar clase teórica) (ppt2) (ppt3)
-Seguridad en el laboratorio (medidas personales, vestimenta, conducta). Cabinas de laboratorio. Niveles de seguridad en laboratorios (P1, P2, P3, P4) ).
-Teoría de propagación de errores aplicado al trabajo en el laboratorio.
-Uso apropiado de pipetas y balanza.
*Práctica:
(descargar guía de
práctica) (material
para práctica)
Preparación de una solución en la cual se determina el error de la concentración
calculada en función del error de las pipetas y balanzas utilizadas. Comparación
de los errores
cuando se utiliza una pipeta de vidrio
y
una micropipeta. Preparación
de un stock
concentrado y realización
de diluciones
seriadas estimando el error acumulado en cada
una
de ellas.
*Links web de interés:
Bioseguridad
-
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4th edition (CDC
guidelines)
- (versión en castellano - pdf)
- Office of Health and Safety (CDC)
Teoría de propagación de errors
-
Teoría de errores (pdf)
-
Propagación de errores
Práctica #2: Calidad de agua y pH. (Miércoles 2)
Coordinador de práctica: Giovanni Poletti
Asistentes de práctica: FB + VS + NC + JO
*Teoría: (descargar clase teórica) (material de lectura recomendado)
-Calidad del agua y pH: (agua no tratada, agua destilada, agua desionizada, agua miliQ)
-Principios de funcionamiento de los sistemas de purificación de agua
-pH y principio de funcionamiento del pH-metros
*Práctica: (descargar guía de práctica) (datos pH)
-Comprobar la calidad de las aguas
- Medición del cambio de pH frente a diluciones de sustancias ácidas y frente a titulaciones ácido-base.
*Links web de interés:
Purificación de agua
-
Water quality standards
-
Laboratory water purification
- Sistemas de purificación millipore
pH y pH-metros
- Operation of a specific pH-meter
- PH_meter
Práctica #3: Buffers. (Jueves 3)
Coordinador de práctica: Patricia Herrera
Asistentes de práctica: OT + VS +
NC + JO
*Teoría:
(descargar clase teórica)
-Teoría general de buffers, -cálculos de concentraciones para preparar buffers. Titulación de buffers con ácidos-bases
*Práctica: (descargar guía de práctica)
Resolución de problemas de buffers. Preparación de buffers selectos. Curvas de titulación de buffers con ácidos.
*Links web de interés:
<<PRIMER EXAMEN – Capítulo I >> (Lunes 7 )
2:00-4:00pm.
Lugar: Aula de prácticas
Profesores encargados: Giovanni Poletti, Patricia Herrera
CAPÍTULO II: TÉCNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS Y BIOCATÁLISIS
Práctica #4: Técnicas espectrofotométricas. (Viernes 4)
Coordinador de práctica: Giovanni Poletti
Asistentes de práctica: FB + OT + NC + JO
*Teoría:
(descargar clase
teórica)
-Espectrofotometría UV-visible, -fluorescencia, -absorción atómica.
*Práctica: (descargar guía de práctica)
-Construir el espectro de absorción en el rango visible de una solución coloreada, e identificar la longitud de onda “característica”.
-Comprobación de la ley de Lambert – Beer. Se mediría la absorbancia para distintas diluciones, escogiendo la longitud de onda “característica”. Graficar absorbancia vs. concentración, y demostrar que esta relación es ‘lineal’ solamente en un cierto rango.
-Calcular el coeficiente de extinción para una solución de concentración conocida
*Links web de interés:
-
Principios básicos de espectrofotometría
-
Spectrophotometry
Práctica #5: Espectros de emisión/absorción. (Lunes 7)
Coordinador de práctica: Jorge Arévalo
Asistentes de práctica: FB + VS +
NC + JO
*Teoría:
(descargar clase
teórica)
(artículo #1)
(artículo #2)
-Espectros de emisión/absorción de sustancias puras, mezclas y reacciones.
*Práctica:
(descargar guía de
práctica)
Medición de los espectros de absorción de sustancias puras, mezclas y
reacciones.
Se deben conseguir dos o tres soluciones con espectros de absorción simples (un solo pico a una cierta longitud de onda). Se medirá individualmente el espectro de absorción en el rango visible de cada solución, así como de la mezcla.
La idea es repetir lo mismo pero para sustancias que formen interacciones (p.ejem: drapkin y hemoglobina)
*Links web de interés:
- Espectros de emisión y absorción
-
Espectro de absorción (básico)
-
Absorción óptica de la hemoglobina
-
...para un relax
Práctica #6: Cinética enzimática. (Martes 8)
Coordinador de práctica: Daniel Clark
Asistentes de práctica: FB + VS + NC + JO
*Teoría:
(descargar clase
teórica)
-Reacciones enzimáticas, -parámetros cinéticos, Kcat, Km.
*Práctica:
(descargar guía de
práctica)
Medición de la actividad enzimática de la pirazinamidasa de mycobacterium
tuberculosis a partir de la reacción de Wayne. Estimación de los parámetros
cinéticos, Kcat y Km. Se medirá la velocidad inicial (velocidad máxima) de la
reacción, para distintas concentraciones iniciales de sustrato (aproximadamente
10). La velocidad inicial se calculará a partir de la medición del producto
producido en 30seg de reacción. Ver el efecto de usar un tiempo mayor de 30seg.
El Kcat y Km se obtendran a partir de la gráfica 1/v vs. 1/s
*Links web de interés:
- Enzimas
- Kinetics of enzymatic reactions
- Introduction to enzyme kinetics
Práctica #7: Inhibición enzimática. (Miércoles 9)
Coordinador de práctica: Patricia Herrera
Asistentes de práctica: FB + VS + NC + JO
*Teoría: (descargar clase teórica) (artículo)
-Inhibición enzimática, -activación por cofactores.
*Práctica: (descargar guía de práctica)
Quelación y reactivación de la actividad enzimática por titulación con su cofactor de la enzima pirazinamidasa. La inhibición se hará usando el sustrato análogo a la pirazinamida (nicotinamida) que no produce ácido pirazinoico y por lo tanto no da reacción colorimétrica en la prueba de Wayne. Se plantea otro tipo de inhibición quelando los iones cofactores con EDTA, ya que la pirazinamidasa es una metalo enzima.
*Links web de interés:
- EDTA
- Aplicaciones médicas de la quelación con EDTA
Práctica #8: Metabolitos secundarios. (Jueves 10)
Coordinador de práctica: Rocío Inga
Asistentes de práctica: FB + VS + NC + JO
*Teoría:
(descargar clase
teórica)
Métodos para la detección de metabolitos en una reacción.
*Práctica:
(descargar guía de
práctica)
Detección de amonio en la reacción de hidrólisis
de la pirazinamida (PZA), por medio de la prueba de Nessler.
*Links web de interés:
- Metabolites: a helping hand for pathway evolution? (artículo completo)
<<SEGUNDO EXAMEN – Capítulo II >> (Lunes 14) 2:00-4:00pm;
Lugar: Aula de prácticas
Profesores encargados: Giovanni Poletti, Jorge Arévalo, Daniel Clark, Patricia Herrera, Rocío Inga.
CAPÍTULO III: PURIFICACIÓN DE PROTEINAS
Práctica #9: Manejo de estructuras moleculares. (Viernes 11) (Lugar: Aula interactiva)
Coordinador de práctica: Mirko Zimic
Asistentes de práctica: FB + OT + NC + JO
*Teoría: (descargar clase teórica)
-Visualización y análisis de estructuras 3D de proteínas:
-Manejo de la base de datos del Protein Data Bank
-Uso del programa de visualización SwissPDViewer
-Alineamiento estructural
*Práctica: (descargar guía de práctica)
*Links web de interés
-
Curso estructuras de proteínas
- Protein-protein interaction as targets for drug design
Práctica #10: Precipitación y diálisis de proteínas. (Lunes 14)
Coordinador de práctica: Carla Gallo
Asistentes de práctica: OT + VS + NC + JO
*Teoría:
(descargar clase
teórica)
-Métodos de precipitación, diálisis, ultra-centrifugación
*Práctica:
(descargar guía de
práctica)
Purificación por precipitación etanólica de un extracto sonicado-homogenizado de
E.coli transformada inducida con IPTG para expresar pirazinamidasa
recombinante de mycobacterium tuberculosis. Se obtendran 5
precipitaciones a distintas concentraciones de etanol, y se les medirá la
actividad de pirazinamidasa mediante la prueba de Wayne.
*Links web de interés
Práctica #11: Cuantificación de proteínas. (Martes 15)
Coordinador de práctica: Carla Gallo
Asistentes de práctica: FB + OT + NC + JO
*Teoría:
(descargar clase
teórica) (art.1)
(art.2)
Cuantificación de proteínas (Método de Bradford, Absorbancia a 280nm)
*Práctica:
(descargar guía de
práctica) (datos
para la práctica)
Cuantificar proteínas por método de Bradford, corrigiendo los estándares de BSA
por medición a 280nm. Las 5 fracciones solubles obtenidas después de la
precipitación serán cuantificadas para medir proteína por el método de Bradford.
*Links web de interés
Práctica #12: Cromatografía de proteínas. (Miércoles 16)
Coordinador de práctica: Daniel Clark
Asistentes de práctica: FB + OT + NC + JO
*Teoría:
(descargar clase
teórica)
Metodos cromatograficos (cromatografia de exclusion e intercambio ionico),
refolding-reactivacion, HPLC.
*Práctica: (descargar guía de práctica) (foto grupo1) (foto grupo2) (foto grupo3) (foto grupo4)
(foto
grupo5) (foto grupo6)
A partir del extracto crudo de E.coli transformada e inducida, se
purificará la pirazinamidasa por medio de cromatografía de exclusión (sephadex
G50) y por medio de cromatografía de intercambio iónico (intercambio aniónico a
pH 5).
*Links web de interés
- Gel filtration and ion-exchange chromatography
Práctica #13: Electroforesis de proteínas. (Jueves 17)
Coordinador de práctica: Rocío Inga
Asistentes de práctica: OT + VS + NC + JO
*Teoría:
(descargar clase
teórica)
Electroforesis SDS-PAGE, -denaturante / no-denaturante, -continua /
gradiente, uno o doble- dimensional, isoelectro-enfoque
*Práctica:
(descargar guía de
práctica) (fotos
geles)
Electroforesis SDS-PAGE de los productos de purificación obtenido e los pasos de
(i) precipitación etanólica, (ii) exclusión molecular, (iii) intercambio iónico.
*Links web de interés
Práctica #14: Herramientas proteómicas. (Viernes 18)
Coordinador de práctica: Mirko Zimic
Asistentes de práctica: OT + VS + NC + JO
*Teoría: (descargar clase teórica)
-Herramientas EXPASY de proteómica:
-Estimación del peso molecular, punto isoeléctrico
-Determinación de solubilidad
-Predicción de péptido líder
-Predicción de localización celular
*Práctica:
(descargar guía de
práctica)
*Links web de interés
<<TERCER EXAMEN>> (Miércoles 23) 12:00 - 2:00 pm
Lugar: Aula de prácticas
Profesores encargados: Carla Gallo, Rocío Inga, Daniel Clark, Mirko Zimic
<<EXAMEN SUSTITUTORIO>> (Viernes 25) 12:00 - 2:00 pm
Lugar: Aula de prácticas
Profesores encargados: Mirko Zimic
